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簡(jiǎn)要描述：呋喃代謝物四合一ELISA檢測(cè)試劑盒組織蜂蜜版采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法定量檢測(cè)樣品中呋喃代謝物的殘留量。定量檢測(cè)組織、蜂蜜樣品中呋喃代謝物的殘留。
產(chǎn)品型號(hào)：呋喃代謝物四合一廠商性質(zhì)：生產(chǎn)廠家更新時(shí)間：2019-01-23訪 問 量：966一、原理
呋喃代謝物四合一ELISA檢測(cè)試劑盒組織蜂蜜版采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法定量檢測(cè)樣品中呋喃代謝物的殘留量。
二、適用范圍
定量檢測(cè)組織、蜂蜜樣品中呋喃代謝物的殘留。
三、呋喃代謝物四合一ELISA檢測(cè)試劑盒組織蜂蜜版特點(diǎn)及技術(shù)指標(biāo)
* 檢 測(cè) 時(shí) 間 ：40min-70min
* 試劑盒檢測(cè)純陰性樣本的背景值＜0.05 ppb；
樣本 | 檢測(cè)下限 | 回收率 |
呋喃唑酮 | 0.2ppb | 70%-120% |
呋喃西林 | 0.2ppb | 70%-120% |
呋喃它酮 | 0.1ppb | 70%-120% |
呋喃妥因 | 0.2ppb | 70%-120% |
試劑盒檢測(cè)樣本的靈敏度、準(zhǔn)確度和特異性：
藥物名稱 | 交叉反應(yīng)率（%） |
呋喃唑酮 | 100% |
呋喃西林 | 100% |
呋喃它酮 | 100% |
呋喃妥因 | 100% |
四、所需材料
儀器：微孔板酶標(biāo)儀450 nm/630 nm、均質(zhì)器、振蕩器、氮吹儀、離心機(jī)、刻度移液管（10 mL）、天平（感量0.01 g）、離心管（5 mL, 50 mL）
微量移液器：10 µL～100µL、100 µL～1000µL
試劑：乙酸乙酯、去離子水、 濃鹽酸 、氫氧化鈉
五、 試劑盒組成
序 | 組成部分 | 96T裝量 |
1 | 呋喃酶標(biāo)板 | 96×4孔 |
2 | 呋喃標(biāo)準(zhǔn)品*5 | 0.5-1mL |
3 | 呋喃酶標(biāo)物 | 40mL |
4 | 呋喃抗體 | 7mL*4 |
5 | 底物液A液 | 28mL |
6 | 底物液B液 | 28 mL |
7 | 終 止 液 | 28mL |
8 | 20×濃縮洗滌液 | 160 mL |
9 | 2×呋喃樣品稀釋液 | 160 mL |
10 | 呋喃衍生化試劑 | 40 mL |
注*：標(biāo)準(zhǔn)品A、B、C、D、E
呋喃它酮標(biāo)準(zhǔn)品：0,0.05,0.15,0.45,1.35ppb；
呋喃妥因標(biāo)準(zhǔn)品：0,0.1,0.3,0.9,2.7ppb；
呋喃唑酮標(biāo)準(zhǔn)品：0,0.1,0.3,0.9,2.7ppb；
呋喃西林標(biāo)準(zhǔn)品：0,0.1,0.3,0.9,2.7ppb；A、B標(biāo)準(zhǔn)品各1mL，其余各0.5mL，直接使用。
六、溶液配制
配液1: 洗滌工作液
用去離子水將20×濃縮洗滌液按1 : 19體積 比進(jìn)行稀釋，用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月，用前一天取出回溫。
配液2: 1×呋喃樣品稀釋液
用去離子水將2×呋喃樣品稀釋液 按1:1體積比進(jìn)行稀釋，用于樣本的稀釋，配好后在4℃環(huán)境可保存六個(gè)月，用前一天取出回溫。
配液3: 0.1 M HCl
量取860 μL濃鹽酸加去離子水/雙蒸水混勻定容至100 mL，濃鹽酸揮發(fā)在通風(fēng)櫥內(nèi)操作。
配液4: 0.1 M NaOH
稱取0.4g 氫氧化鈉加去離子水溶解定容至100ml。
七、樣本前處理
樣本處理前須知：
① 處理完的樣品應(yīng)及時(shí)進(jìn)行下步檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時(shí)要更換吸頭。
② 樣本數(shù)目超過8個(gè)時(shí)推薦使用排槍加樣。
動(dòng)物組織、蜂蜜 （稀釋倍數(shù)：2）
① 稱取2.0±0.05g均質(zhì)后的樣本，加入8ml
0.1 M HCl 和400μL 呋喃衍生化試劑，用振蕩器充分振蕩1min；
② 置于37 ℃過夜孵育（大約16h）；
③ 分別加入8 ml 0.1 M NaOH和20ml乙酸乙酯，用振蕩器劇烈振蕩30s；
④ 4000r/min，室溫（20～25℃/68-77℉）離心5min；
⑤ 取上層10ml乙酸乙酯相至離心管中，于50～60℃氮?dú)饬飨麓蹈桑?/span>
⑥ 加入1.6 ml 1×呋喃樣品稀釋液（動(dòng)物組織、蜂蜜），用渦旋儀渦動(dòng)60s使干燥物溶解，用于分析。
八、 酶標(biāo)免疫測(cè)定程序
呋喃唑酮、呋喃西林：
（1）加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品、酶、抗體：加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品50µL 到對(duì)應(yīng)的微孔中，加入呋喃酶標(biāo)物50µL /孔， 再加入呋喃唑酮/呋喃西林抗體50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。
（2）洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加入洗滌工作液250 µL/孔，每次靜置20s，甩去孔內(nèi)液體，重復(fù)洗滌3次，后一次用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。
（3）顯色：加入底物液A液50 µL/孔，再加底物液B液50 µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應(yīng)10min。
（4）測(cè)定：加入終止液50µL/孔，用酶標(biāo)儀立即 測(cè)定雙波長(zhǎng)450/630nm吸光度值。
呋喃它酮、呋喃妥因：
（1）加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品、抗體：加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品100µL
到對(duì)應(yīng)的微孔中，再加入呋喃它酮/妥因抗體50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃反應(yīng)30min。
（2）洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加入洗滌工作液250µL/孔，每次靜置20s，甩去孔內(nèi)液體，重復(fù)洗滌3次，后一次用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。
（3）加酶標(biāo)物100µL/孔，用蓋板膜蓋板后置37℃反應(yīng)30min。
（4）洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加入洗滌工作液250µL/孔，每次靜置20s，甩去孔內(nèi)液體，重復(fù)洗滌3次，后一次用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。
（5）顯色：加入底物液A液50µL/孔，再加底物
液B液50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃反應(yīng)10min。
（6）測(cè)定：加入終止液50µL/孔，用酶標(biāo)儀立即測(cè)定450nm處的吸光度值（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm）檢測(cè)。
九、 結(jié)果判定
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以呋喃標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃實(shí)際濃度。（詳見試劑盒專業(yè)分析軟件，以便進(jìn)行大量樣本的分析計(jì)算。）
十、 注意事項(xiàng)
① 洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
② 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
③ 不使用過了有效期的試劑盒，不交換使用不同批號(hào)的試劑。
④ 0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
⑤ 在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色時(shí)間為15min即可。若顏色較淺，可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到20-30min，反之則減短反應(yīng)時(shí)間。
⑥ 未提及樣本請(qǐng)致電本公司技術(shù)服務(wù)部。
十一、貯藏條件及保存期
貯藏條件： 2～8℃
保 質(zhì) 期： 12個(gè)月
十二、問題與對(duì)策
序號(hào) | 現(xiàn)象 | 可能原因 | 解決方法 |
1 | 板條不顯色或者無相應(yīng)數(shù)值 | 試劑使用順序混亂，或操作步驟出錯(cuò) | 嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)說明重復(fù)實(shí)驗(yàn) |
使用了不同批次的試劑 | 確保試劑來自同一試劑盒 | ||
板條受潮嚴(yán)重 | 板條要封好，干燥劑失效要及時(shí)更換 | ||
2 |
低 吸 光 度
OD 值
| 試劑過期，或者不同的批次混用 | 查證過期試劑和批次 |
洗液配制錯(cuò)誤、洗滌浸泡時(shí)間過長(zhǎng) | 按照說明書要求洗滌，并正確配制洗液 | ||
孵育時(shí)間過短 | 按照說明書要求，嚴(yán)格計(jì)算好時(shí)間 | ||
試劑污染 | 確保吸取不同液體更換新的槍頭和盛放器皿 | ||
試劑溫度過低 | 根據(jù)試劑體積大小回溫時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)，確保試劑*回溫 | ||
使用錯(cuò)誤波長(zhǎng)讀數(shù)，或者酶 標(biāo)儀失靈 | 確保450nm波長(zhǎng)讀數(shù)，檢查酶標(biāo)儀是否故障 | ||
試劑盒處于的條件 | 使用完畢的部分請(qǐng)立即放回冰箱，勿置于過熱環(huán)境時(shí)間太長(zhǎng) | ||
3 | 過高的 背景值或吸光度（OD值） | 使用了質(zhì)量差的水配制試劑 | 使用雙蒸水或去離子水配制試劑 |
洗滌不當(dāng)或者洗板機(jī)洗板效果不好 | 增加1-2次洗滌，每孔至少加入250μL洗液 | ||
酶標(biāo)儀失靈，如OD值讀數(shù)很高而顏色很淺 | 使用校正微孔板檢查酶標(biāo)儀，檢查光源 | ||
實(shí)驗(yàn)室溫度過高，反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng) | 測(cè)定操作溫度是否合適，時(shí)間是否計(jì)算正確 | ||
試劑混淆，被污染或者配制不當(dāng) | 確保使用正確的試劑，準(zhǔn)確配制，避免污染 | ||
4
| 板 內(nèi) 差異性 大 | 加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品等的時(shí)間不* | 使用多道槍加樣，同種試劑加樣途中不能中斷 |
多道槍使用不當(dāng) | 校準(zhǔn)多道槍，檢查吸嘴是否套緊，確保吸液量* | ||
洗滌系統(tǒng)出現(xiàn)故障 | 檢查洗滌系統(tǒng)，保持良好運(yùn)行 | ||
5 | 板 間 差 異 性 大
| 板與板之間孵育時(shí)間相差太大 | 獨(dú)立計(jì)時(shí)，確保*的孵育時(shí)間 |
板與板之間不*的洗滌過程 | 確保相同的洗滌次數(shù)，保證洗滌系統(tǒng)正常運(yùn)作 | ||
使用移液槍不當(dāng) | 檢查移液槍，確保吸取相同液量 | ||
試劑和樣品處于不同溫度 | 確保盒內(nèi)試劑和樣品液等充分回溫，如果試劑體積較大則需要回溫較長(zhǎng)時(shí)間。不能用溫水浴回溫樣品 | ||
不同批次的試劑混用，或試劑盒過期 | 試劑不要混用，通常0標(biāo)準(zhǔn)品的OD值小于0.5顯示試劑質(zhì)量下降 | ||
6 | 一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)點(diǎn)超出曲線范圍 | 標(biāo)準(zhǔn)品添加順序混亂，或者放置于錯(cuò)誤位置 | 按照說明要求重復(fù)實(shí)驗(yàn)，保證標(biāo)準(zhǔn)品添加正確。 |
標(biāo)準(zhǔn)品被污染或與其他標(biāo)準(zhǔn)品混淆 | 改用新的標(biāo)準(zhǔn)品，按照由低濃度到高濃度的順序添加標(biāo)準(zhǔn)品 | ||
洗滌不*或者洗滌系統(tǒng)失靈 | 遵循一如既往的洗滌方式，檢查洗滌系統(tǒng) | ||
加入標(biāo)準(zhǔn)品和試劑的時(shí)間不* | 由低到高濃度依次添加標(biāo)準(zhǔn)品，使用多道槍移液 | ||
多道槍使用不當(dāng) | 校準(zhǔn)多道槍，檢查吸嘴是否套緊，確保吸液量* |
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